Fmoc固相多肽合成步驟示例:合成多肽ACDER
1、合成CTC樹(shù)脂:稱取0.3g CTC Resin(如初始取代度約為1.0mmol/g)和0.4 mmol的Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反應(yīng)器中,加入適量DCM溶解氨基酸(需要注意,此時(shí)CTC樹(shù)脂體積會(huì)增大好幾倍,避免DCM溶液過(guò)少),再加入樹(shù)脂0.9 mmol的DIPEA((Mw:129.1,d:0.740g/ml)),反應(yīng)2-3小時(shí)后,可不抽濾溶液,直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇,封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次,甲醇洗滌1次,DCM洗滌一次,甲醇洗滌一次,DCM洗滌一次,DMF洗滌2次(這里使用甲醇和DCM交替洗滌,是為了更好地去除其他溶質(zhì),有利于后續(xù)反應(yīng))。得到Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin備用。
2、脫Fmoc:加3倍樹(shù)脂體積的20%Pip/DMF溶液,鼓氮?dú)?0分鐘,然后2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌5次。得到H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin。(此步驟脫除Fmoc基團(tuán),茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色)
3、縮合:取2.7mol Fmoc-Glu(OtBu)-OH 氨基酸,加入到上述樹(shù)脂里,加適當(dāng)DMF溶解氨基酸,再分別加入1.8mol DIPEA,1.67mol HBTU。反應(yīng)30分鐘后,用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂。(洗滌樹(shù)脂,去掉殘留溶劑,為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備)。得到Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸:DIPEA:HBTU:樹(shù)脂=3:6:2.85:1(摩爾比)。
4、依次循環(huán)步驟二和步驟三,*終得到H2N-Ala-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
5、切割:6倍樹(shù)脂體積的切割液(或每1g樹(shù)脂加8ml左右的切割液),搖床搖晃 2小時(shí),過(guò)濾掉樹(shù)脂,用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液,并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次,*后將沉淀物放真空干燥釜中,常溫干燥24小試,得到粗品 Ala-Cys-Asp-Glu-Arg
切割液選擇:
1)TFA:H2O=95%:5%、TFA:H2O=97.5%:2.5%
2)TFA:H2O:TIS=95%:2.5%:2.5%
3)三氟乙酸:茴香硫醚:1,2-乙二硫醇:苯酚:水=87.5%:5%:2.5%:2.5%:2.5%
(前兩種適合沒(méi)有容易氧化的氨基酸,例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。)
6、純化凍干:使用液相色譜純化,收集目標(biāo)峰液體,進(jìn)行凍干,獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過(guò)這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。
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